引物的tm值與gc含量多少合適

① 引物的TM值如何計算

Tm(解鏈溫度)是指50%雙鏈被解開成單鏈時的溫度。寡核苷酸濃度和鹽濃度會影響Tm值的大小。

Tm值有多種計算方法。我們使用近鄰法(PNAS83,3746-50)來計算。用這種方法計算前，也有多種方法來估測。如果是15個鹼基以下，那麼有一種好的方法來估算，對於A和T，可以乘以2癈，對於C和G，可以乘以4癈然後相加，這叫做Wallace法則。

Tm=2℃(A+T)+4℃(G+C)

另一種方法來估計長鏈中GC含量

Tm=81.5+0.41(%GC)-500/L+16.6log[M]

(L:寡核苷酸的長度；M:1價陽離子的濃度)

但這些方法不能消除鹼基堆積的影響，結果並不準確，所以近鄰法被廣泛的應用。但是，對於在60-70bp或15bp以下的寡核苷酸的測定，近鄰法還是有缺點。

Bioneer使用的近鄰法具有新的特點。它考慮到在退火過程中不同的鹼基序列的影響，並且通過熱力學來測定，可以更有效的測定Tm值。比如5'-GC-3'和5'-CG-3'的序列用熱力學方法測定結果是不同的。計算方法見截圖：

依靠熱力學方法，焓和熵通過兩個鹼基來確定。[salt]是指一價陽離子的濃度，[Oligo]是指反應過程中的寡核苷酸濃度。R是指氣體常數(1.987cal•K-1mol-1)。Bioneer用近鄰法計算Tm值時，使用的是50mM的鹽濃度和1nM的寡核苷酸的濃度。

Bioneer會給每一個用戶提供Tm值，但這只是估計值，我們不能保證精確性，因此這個值僅供用戶參考。

如果沒有擴增出產物，你可以把退火溫度降到Tm值以下4～5癈。如果有許多非特異性的產物，你需要改變實驗條件如提高退火溫度以得到正確的產物。

② pcr實驗詳細步驟是怎麼樣的

1、模板的取材主要依據PCR的壙增對象，可以是病原體標本如病毒、也可以是病理生理標本如細胞等。

2、標本處理的基本要求是除去雜質，並部分純化標本中的核酸。多數樣品霓要經過SDS和蛋白 酶K處理。難以破碎的細菌，可用溶菌酶加EDTA處理。

3、引物最好在模板cDNA的保守區內設計，引物長度一般在15~30鹼基之間，引物長度常用的是18~27 bp，但不應大於38，因為過長會導致其延伸溫度大於74℃，不適於Taq DNA 聚合酶進行反應

4、引物GC含量在40%~60%之間，Tm值最好接近72℃，GC含量過高或過低都不利於引發反應。上下游引物的Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度

5、引物3』端要避開密碼子的第3位，引物3′端不要終止於密碼子的第3位，引物3′端不能選擇A，最好選擇T，引物3′端錯配時，不同鹼基引發效率存在著很大的差異。

(2)引物的tm值與gc含量多少合適擴展閱讀：

PCR能快速特異擴增任何已知目的基因或DNA片段，並能輕易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因擴增達到納克、微克、毫克級的特異性DNA片段。因此，PCR技術一經問世就被迅速而廣泛地用於分子生物學的各個領域。

通過DNA基因追蹤系統，能迅速掌握患者體內的病毒含量，其精確度高達納米級別，精確檢測乙肝病毒在患者體內存在的數量、是否復制、是否傳染、傳染性有多強、是否必要服葯、肝功能有否異常改變。

能及時判斷病人最適合使用哪類抗病毒葯物、判斷葯物療效如何、給臨床治療提供了可靠的檢驗依據。

重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的「半保留復制鏈」，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。

③ pcr引物設計時，兩條引物GC含量相差多少以內合適，12%可以么

一般不能但看GC含量，而要由引物的Tm值來綜合判斷，一般Tm值在2C以內。而Tm值主要由兩個因素控制：GC含量和鹼基數目。只要GC含量在40－60%都是可以接受的。12%只要Tm值不超過2C，應該是可以的。但是，您為何要選擇相差這么大的引物？可以考慮其它引物啊？除非您要特定區域的，比如要包含起始密碼子？

④ 我設計了個PCR引物，但是Tm50度多一點，GC含量40多一點，應該如何修改

就這兩個數來看其實可以用了。Tm在50-60，GC%在35-50其實都可以。重要的數據是，你的false priming的預測如何，就是預測的錯配概率是多少。另外是否有莖環結構，引物二聚體概率多少，這些是關鍵數據。你用軟體預測一下，都是可以算的。只要這些的概率不大，就沒什麼問題的。另外你的primer多長？如果不放心的話可以在增加幾個nt，提高tm到60，也就是了。不過這真的不關鍵，畢竟可以做gradient PCR的。

⑤ gc含量太低的引物可以用嗎

gc含量太低的引物不可以用。

同一鹼基連續出現不應超過5個，GC含量一般40-60%，GC含量太低導致引物Tm值較低，使用較低的退火溫度不利於提高PCR的特異性，GC含量太高也易於引發非特異擴增。

引物長度一般在15~30鹼基之間：

引物長度（primer length）常用的是18-27 bp，但不應大於38，因為過長會導致其延伸溫度大於74℃，不適於Taq DNA聚合酶進行反應。
引物GC含量在40%~60%之間，Tm值zui好接近72℃。GC含量（composition）過高或過低都不利於引發反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。

另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動溫度，一般高於Tm值5~10℃。若按公 式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為55~80℃。

⑥ 設計pca引物 主要需要注意哪幾點

PCR引物設計的11條黃金法則

1.引物最好在模板cDNA的保守區內設計。
DNA序列的保守區是通過物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟體（比如DNAman）比對（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區。

2.引物長度一般在15~30鹼基之間。
引物長度（primer length）常用的是18-27 bp，但不應大於38，因為過長會導致其延伸溫度大於74℃，不適於Taq DNA 聚合酶進行反應。

3.引物GC含量在40%~60%之間，Tm值最好接近72℃。
GC含量（composition）過高或過低都不利於引發反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動溫度，一般高於Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使復性條件最佳。

4.引物3′端要避開密碼子的第3位。
如擴增編碼區域，引物3′端不要終止於密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發生簡並，會影響擴增的特異性與效率。

5.引物3′端不能選擇A，最好選擇T。
引物3′端錯配時，不同鹼基引發效率存在著很大的差異，當末位的鹼基為A時，即使在錯配的情況下，也能有引發鏈的合成，而當末位鏈為T時，錯配的引發效率大大降低，G、C錯配的引發效率介於A、T之間，所以3′端最好選擇T。

6. 鹼基要隨機分布。
引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是3』端相似性較高的序列，否則容易導致錯誤引發（False priming）。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種鹼基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應超過3個連續的G或C，因這樣會使引物在GC富集序列區錯誤引發。

7. 引物自身及引物之間不應存在互補序列。
引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發夾結構（Hairpin）使引物本身復性。這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。引物自身不能有連續4個鹼基的互補。
兩引物之間也不應具有互補性，尤其應避免3′ 端的互補重疊以防止引物二聚體（Dimer與Cross dimer）的形成。引物之間不能有連續4個鹼基的互補。
引物二聚體及發夾結構如果不可避免的話，應盡量使其△G值不要過高（應小於4.5kcal/mol）。否則易導致產生引物二聚體帶，並且降低引物有效濃度而使PCR 反應不能正常進行。

8. 引物5′ 端和中間△G值應該相對較高，而3′ 端△G值較低。
△G值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能，它反映了雙鏈結構內部鹼基對的相對穩定性，△G值越大，則雙鏈越穩定。應當選用5′ 端和中間△G值相對較高，而3′ 端△G值較低（絕對值不超過9）的引物。引物3′ 端的△G 值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構並引發DNA 聚合反應。（不同位置的△G值可以用Oligo 6軟體進行分析）

9.引物的5′端可以修飾，而3′端不可修飾。
引物的5′ 端決定著PCR產物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5′ 端修飾包括：加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質結合DNA序列；引入點突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動子序列等。
引物的延伸是從3′ 端開始的，不能進行任何修飾。3′ 端也不能有形成任何二級結構可能。

10. 擴增產物的單鏈不能形成二級結構。
某些引物無效的主要原因是擴增產物單鏈二級結構的影響，選擇擴增片段時最好避開二級結構區域。用有關軟體（比如RNAstructure）可以預測估計mRNA的穩定二級結構，有助於選擇模板。實驗表明，待擴區域自由能（△G°）小於58.6l kJ/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區域時，用7-deaza-2′-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。

11. 引物應具有特異性。
引物設計完成以後，應對其進行BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補性，就可以進行下一步的實驗了。

值得一提的是，各種模板的引物設計難度不一。有的模板本身條件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導致找不到各種指標都十分合適的引物；用作克隆目的的PCR，因為產物序列相對固定，引物設計的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。
做Real Time時,用於SYBR Green I法時的一對引物與一般PCR的引物,在引物設計上所要求的參數是不同的。引物設計的要求：
1)避免重復鹼基，尤其是G.
2)Tm=58-60度。
3）GC=30-80%.
4)3'端最後5個鹼基內不能有多於2個的G或C.
5)正向引物與探針離得越近越好，但不能重疊。
6)PCR擴增產物長度： 引物的產物大小不要太大，一般在80-250bp之間都可；80～150 bp最為合適（可以延長至300 bp）。
7)引物的退火溫度要高，一般要在60度以上；

要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴增的存在。

而且引物設計時應該考慮到引物要有不受基因組DNA污染影響的能力，即引物應該跨外顯子，最好是引物能跨外顯子的接頭區，這樣可以更有效的不受基因組DNA污染的影響。

至於設計軟體，PRIMER3,PRIMER5,PRIMER EXPRESS都應該可以的。

做染料法最關鍵的就是尋找到合適的引物和做污染的預防工作。對於引物，你要有從一大堆引物中挑出一兩個能用的引物的思想准備---尋找合適的引物非常不容易。

關於BLAST的作用應該是通過比對，發現你所設計的這個引物，在已經發現並在GENEBANK中公開的不物種基因序列當中，除了和你的目標基因之外，還有沒有和其他物種或其他序列當中存在相同的序列，如和你的目標序列之外的序列相同的序列，則可能擴出其他序列的產物，那麼這個引物的特異性就很差，從而不能用。

⑦ 熒光定量PCR引物設計

完全可以，PCR長度從50bp到數百都可以，不止局限於150-300個鹼基對。樓上說的有道理，但是有一點要注意，最好計算一下擴增片段的Tm值，這樣做溶解曲線的時候，光有一個峰還不夠，而且得到的TM和你計算的Tm相吻合才行。
是否在翻譯區沒有影響。

⑧ 引物的GC%很大，行嗎

一般40%-60%,70%-80%問題應該也不大，GC含量高，TM值高，正常情況下是可以擴增出來的

⑨ 引物設計問題

引物設計原則：

1。長度 一般為15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大於38，因為過長會導致其延伸溫度大於74℃，即Taq酶的最適溫度
2。鹼基分布的均衡性 同一鹼基連續出現不應超過5個
GC含量一般40-60%
GC含量太低導致引物Tm值較低，使用較低的退火溫度不利於提高PCR的特異性
GC含量太高也易於引發非特異擴增。
3。引物Tm值 一般要求：55℃-65℃。
計算：
對於低於20個鹼基的引物，Tm值可根據Tm=4(G+C)+2(A+T)來粗略估算
對於較長引物，Tm值則需要考慮熱動力學參數，從「最近鄰位」的計算方式得到，這也是現有的引物設計軟體最常用的計算方式。
Tm = △H/(△ S + R * ln (C/4)) + 16.6 log ([K+]/(1 + 0.7 [K+])) - 273.15
4。引物二級結構 引物二聚體
盡可能避免兩個引物分子之間3』端有有較多鹼基互補
發夾結構
尤其是要避免引物3』端形成發夾結構，否則將嚴重影響DNA聚合酶的延伸。
5。引物3』端 引物的延伸從3』端開始，因此3』端的幾個鹼基與模板DNA均需嚴格配對，不能進行任何修飾，否則不能進行有效的延伸，甚至導致PCR擴增完全失敗。考慮到密碼子的簡並性，引物3』端最後一個鹼基最好不與密碼子第三個鹼基配對。
6。引物5』端 引物5』端可以有與模板DNA不配對鹼基，在5』端引入一段非模板依賴性序列。
5』端加上限制性核酸內切酶位點序列（酶切位點5』端加上適當數量的保護鹼基）。
5』端的某一位點修改某個鹼基，人為地在產物中引入該位點的點突變以作研究。
5』端標記放射性元素或非放射性物質（如生物素、地高辛等）。
6。引物的內部穩定性 過去認為，引物3』端應牢牢結合在模板上才能有效地進行延伸，故3』端最好為G或C。
現在的觀點認為，引物的5』端應是相對穩定結構，而3』端在鹼基配對的情況下最好為低穩定性結構，即3』端盡可能選用A或T，少用G或C。
僅僅3』端幾個鹼基與非特異位點上的鹼基形成的低穩定性結構是難以有效引發引物延伸的。
如果3』端為富含G、C的結構，只需3』端幾個鹼基與模板互補結合，就可能引發延伸，造成假引發。
7。引物的保守性與特異性 保守性：通用引物——檢測同一類病原微生物盡可能多的型別
特異性：避免非特異性擴增

⑩ 所謂引物的Tm值，到底有多少意義

Tm較低，而且熔解溫度范圍較寬；離子強度較高時，Tm較高，熔解溫度范圍較窄。

DNA溶液中離子強度低時，Tm較低，而且熔解溫度范圍較寬；離子強度較高時，Tm較高，熔解溫度范圍較窄。因此，在表示某一來源DNA的Tm值時，必須指出其測定條件。

在一定條件下Tm高低由DNA分子中的G-C含量所決定。G-C含量高時，Tm值比較高，反之則低。這是因為G-C之間的氫鍵較A-T多，解鏈時需要較多的能量之故。Tm值和G-C的含量可用二一個經驗公式表示：（G—C）%=（Tm-69.3）×2.44。

(10)引物的tm值與gc含量多少合適擴展閱讀：

引物使用的相關要求：

1、PCR擴增產物長度： 引物的產物大小不要太大，在80-250bp之間都可；80～150 bp最為合適（可以延長至300 bp）。

2、引物3′端錯配時，不同鹼基引發效率存在著很大的差異，當末位的鹼基為A時，即使在錯配的情況下，也能有引發鏈的合成，而當末位鏈為T時，錯配的引發效率大大降低，G、C錯配的引發效率介於A、T之間，所以3′端最好選擇T。

3、引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是3』端相似性較高的序列，否則容易導致錯誤引發。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種鹼基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。