兩個酶切位點相隔多少比較合適

1. 酶切位點怎麼選擇

酶切位點的距離太小（小於10bp），影響限制性內切酶對切點的識別，不利於空載體的雙酶切（會切不開喲！）
（1）一般目的基因用於克隆表達的情況下，酶切位點的選擇要考慮到：
目的基因片段內部不含有所選的酶切位點（不然鑒定陽性重組子雙酶切時會將目的基因切斷）
（2）實驗後繼應用的所有載體(真核、原核、酵母、昆蟲)都盡可能含有所選的酶切位點．並且要保證在載體上的插入方向正確（定向克隆）。（不然換載體表達時，還要重新設計引物，以引進新的酶切位點）
（3）盡可能選比較常用的酶切位點。（常用切點酶的價格比較便宜）

2. 質粒上有兩組相同的酶切位點，越遠越容易切開嗎

酶切位點前後有一定數量的鹼基可以保證酶活性單元有效結合，並有效進行酶切反應，一般情況下稍微遠點是會更有效，但是如果你使用的酶存在星活性或其他鈍化特性，那就要好好看看了~

3. 載體上臨近的兩個酶切位點可以設計起來做雙酶切嗎

酶切專家(站內聯系TA)
這的看具體情況,一般來說,不建議用緊鄰的兩個酶切位點,可能影響其中一個的酶切效率.但也需要具體情況來分析,如果可能,將你的具體序列發上來,大家幫你分析XOooZzz(站內聯系TA)
做是可以,不過建議酶切後用CIAP處理,以防止裡面的單酶切片段自連.
cicelyzh(站內聯系TA)
要根據距離和哪種限制酶的情況而定.有些能切開,有些不行.
jwucn(站內聯系TA)
:hand:.幫您頂一個.:hand:zqxabc(站內聯系TA)
可以的,臨近的兩個酶切位點可以分步酶切,一個一個切,先切一個,然後不跑膠直接加Binding buffer過柱洗脫,回收產物再進行下一個酶切.因分步酶切有損耗,所以質粒的量可以增加以保證回收濃度joan198108(站內聯系TA)
盡量不要,臨近位點可能導致一個酶的結合影響另一個酶的結合,還有就是有些酶需要的結合片段較長,分步酶切後也不一定能夠實現山水88(站內聯系TA)
可以的話把序列放上來大家給你分析吧
...山雨(站內聯系TA)
這樣子不好,酶切的效果好需要一定長度是保護鹼基,挨著的位點切不動,分步切的話,buffer不一樣,效果也非常一般,建議在引物上加酶切位點,這樣就不受載體的限制了.
cory0931(站內聯系TA)on yr re:
質粒的兩個酶切位點,緊挨著的話,勢必會影響雙酶切效果,原因是：
內切酶結合時,一般都是需要微點周圍有多餘鹼基,否則影響結合；
再者,酶切後的粘性末端不余怒重合；
若是連個酶切位點之間有幾個鹼基的間隔,比如說6個以上,一般是可以的；
至少,也得間隔4個鹼基吧；
若是直接沒有間隔,目前貌似沒有多少成功的文獻可循；wx1990(站內聯系TA)
理論上可以,我最近做了個雙酶切實驗,兩個酶切位點之間相隔五六個鹼基,效果不錯,但是最好不要緊挨著

4. 構建表達載體時，兩個基因之間要間隔多少序列

先看錶達載體有哪些合適的酶切位點，比如NdeI,NcoI這樣識別序列有ATG起始密碼子的，再看看目的基因含不含有這些位點，含有就不好連接了，挑好位點，計算下讀碼框是否正確，保證核糖體結合位點後的第一個ATG與目的基因是間隔3的倍數個鹼基。下游的位點更好選，如果有6xHis標簽，想融合表達的話，就注意下要是同一讀碼框，同時利用載體的終止密碼子，如果沒有這樣的需要，就利用目的基因本身的終止密碼子好了。基本是這樣，具體還是看看書吧。

5. 酶切位點選擇與閱讀框的調整

【案例】

使用雙酶切的方式將一段基因序列插入pDsRed2-N1質粒中，使其能夠與DsRED蛋白進行融合表達。

【1. 序列導入】

pDsRed2-N1質粒可以直接在SnapGene的序列庫中找到，導入方式在前面的文章中已經介紹，這里不再贅述。從圖譜中選擇多克隆位點區域MCS，點擊，並轉到序列頁面：

同時，新建DNA序列，將目的基因的序列粘貼進去，用於後續的酶切位點分析。

敲黑板！！！

【2. 酶切位點分析】

雙酶切連接的酶需要滿足以下要求：

一、酶切位點需要存在於MCS中，但同時不能存在於目的基因序列中。

二、兩個酶切位點之間至少要有幾個鹼基間隔，不能緊鄰或重疊。

三、最好選擇成熟的內切酶。

四、結合實驗室酶庫，最好保證內切酶能在同一最佳緩沖液進行反應

五、雙酶切後末端不會發生自連

按照以上原則，我們先看基因中的常見酶切位點：

然後在MCS中排除這些酶切位點：

之後在剩下的酶切位點中，選擇常用的即可，因為HindIII、EcoRI兩個酶切位點靠的太近，沒有選擇這兩個的組合，以免造成雙酶切的效率下降。因此，最終選擇的是EcoRI+KpnI的酶切組合。同時，發現EcoRI酶和KpnI酶的最佳NEB反應緩沖液不一樣，查看EcoRI酶和KpnI酶的TAKARA雙酶切體系，推薦使用TAKARA的M緩沖液。

【3. 調整融合表達的閱讀框】

因為目的基因需要融合下游的熒光蛋白進行示蹤，所以調整閱讀框的通順性是非常重要的，首先將目的基因中的終止密碼子去除，然後將載體上EcoRI+KpnI之間的序列替換為去除終止密碼子之後的目的基因的序列：

觀察目的基因向下游表達至DsRed2中的氨基酸序列（HGL），發現與DsRed2原始序列（MAS）不同，即發生了移碼，完整的閱讀框遭到了破壞。因此，我們需要在目的基因下游與KpnI之間添加鹼基恢復其閱讀框的正確。

從上圖中可以看出，當添加了兩個鹼基之後，之前的兩個不同的氨基酸序列合二為一，變為正確的序列，即目的Gene可以跟下游的DsRed2基因進行正確的融合表達了。(如果您的蛋白序列3端不是核心功能區，去掉一個鹼基同樣可以修復閱讀框)

6. tdna插入的引物設計在哪比較合適

先用軟體設計出合適的引物，引物的3』端是引發延伸的起點，因此一定要與模板准確配對， 應盡量避免在引物 3』端的第一位鹼基是 A。（容易錯配）引物 3』端最佳鹼基的選擇是 C，因為他們形成的鹼基配對比較穩定。目的序列上並不存在的附加序列，如限制位點和啟動子序列，可以加入到引物5'端而不影響特異性。當計算引物Tm 值時並不包括這些序列， 但是應該對其進行互補性和內部二級結構的檢測。 酶切位點都需要保護鹼基以利於內切酶的有效切割。酶切位點前加保護鹼基 1，兩個酶切點 至少隔上3 個鹼基，在做載體構建的時候設計引物擴增片段進行定向連接，除了酶切位點， 還要在兩端加一個三個核苷酸的保護序列，否則 PCR 產物很難被酶切，因此就會導致連接 失敗，因為內切酶需要一定的輔助性鹼基才能順利切割，在沒有輔助鹼基的情況下，有的酶 是可以切割的

7. 相隔1Kb的兩個酶切位點在進行雙酶切時會破壞彼此的酶切位點嗎如果會,有沒有避免的方法謝謝!

這個距離隔得算是還可以啊，一般一個酶的作用位點才4-6個鹼基，1000個鹼基還相互干擾的比較少。如果特別擔心，可以換成兩次單酶切，先切A，稍微過下柱子，再切B，如果沒有問題，反過來用B先切，過柱後再切A。如果兩種都沒問題，可能要考慮是不是兩種酶一起雙酶切的時候，buffer或者溫度選的不合適，或者是其中一個酶產生了星號活性，有非特異切割，導致你目前碰到的問題。
如果上述都沒問題，那麼說明AB兩個酶一起雙切是不應該有問題。如果發現找不到合適的通用buffer，最後就還是只能分開切了。

8. 質粒圖譜上兩個酶切位點距離太近6bp影響酶切嗎

要具體看這兩個酶的序列之間隔了多少個bp，有些酶的話隔的太近的話
雙酶切
效率很低，需要分別單酶切；還有就是如果這兩個酶共用鹼基的話就不行，兩個酶只相當於一個酶。

9. 載體雙酶切時兩酶切位點距離12bp容易切嗎

這個可以切，不過最好還是選擇兩個相距較好的切比較好。

10. 如果我做雙酶切的話，兩個酶切位點之間距離很近總是切不出來，怎麼辦請求高手指點。

如果你是切載體，那是沒有辦法避免的，載體上最遠的酶切位點在電泳上也是看不出來的，如果你用的酶是不同的緩沖液，那就先用低鹽切，然後用高鹽切，應該沒有問題，我們實驗室就是這樣做的，要不就先用一種鹽切，然後用酒精洗滌沉澱一下，再換另一個酶切，應該也是可以的