引物tm值多少合適

『壹』 設計PCR引物時Tm溫度有沒有具體要求比如說，Tm必須小於72度，或大於72度

PCR引物的Tm最好在55℃以上，以減少引物錯配。一般以60℃~65℃左右為宜。

『貳』 pcr引物設計的基本原則有哪些

PCR引物設計的11條黃金法則

1.引物最好在模板cDNA的保守區內設計。 DNA序列的保守區是通過物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟體（比如DNAman）比對（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區。

2.引物長度一般在15~30鹼基之間。 引物長度（primerlength）常用的是18-27bp，但不應大於38，因為過長會導致其延伸溫度大於74℃，不適於TaqDNA聚合酶進行反應。

3.引物GC含量在40%~60%之間，Tm值最好接近72℃。 GC含量（composition）過高或過低都不利於引發反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動溫度，一般高於Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使復性條件最佳。

4.引物3′端要避開密碼子的第3位。 如擴增編碼區域，引物3′端不要終止於密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發生簡並，會影響擴增的特異性與效率。

5.引物3′端不能選擇A，最好選擇T。 引物3′端錯配時，不同鹼基引發效率存在著很大的差異，當末位的鹼基為A時，即使在錯配的情況下，也能有引發鏈的合成，而當末位鏈為T時，錯配的引發效率大大降低，G、C錯配的引發效率介於A、T之間，所以3′端最好選擇T。

6.鹼基要隨機分布。引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是3』端相似性較高的列，否則容易導致錯誤引發（Falsepriming）。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種鹼基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應超過3個連續的G或C，因這樣會使引物在GC富集序列區錯誤引發。

7.引物自身及引物之間不應存在互補序列。引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發夾結構（Hairpin）使引物本身復性。這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。引物自身不能有連續4個鹼基的互補。兩引物之間也不應具有互補性，尤其應避免3′端的互補重疊以防止引物二聚體（Dimer與Crossdimer）的形成。引物之間不能有連續4個鹼基的互補。引物二聚體及發夾結構如果不可避免的話，應盡量使其△G值不要過高（應小於4.5kcal/mol）。否則易導致產生引物二聚體帶，並且降低引物有效濃度而使PCR反應不能正常進行。

8.引物5′端和中間△G值應該相對較高，而3′端△G值較低。 △G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，它反映了雙鏈結構內部鹼基對的相對穩定性，△G值越大，則雙鏈越穩定。應當選用5′端和中間△G值相對較高，而3′端△G值較低（絕對值不超過9）的引物。引物3′端的△G值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構並引發DNA聚合反應。（不同位置的△G值可以用Oligo6軟體進行分析）

9.引物的5′端可以修飾，而3′端不可修飾。 引物的5′端決定著PCR產物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5′端修飾包括：加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質結合DNA序列；引入點突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動子序列等。引物的延伸是從3′端開始的，不能進行任何修飾。3′端也不能有形成任何二級結構可能。

10.擴增產物的單鏈不能形成二級結構。某些引物無效的主要原因是擴增產物單鏈二級結構的影響，選擇擴增片段時最好避開二級結構區域。用有關軟體（比如RNAstructure）可以預測估計mRNA的穩定二級結構，有助於選擇模板。實驗表明，待擴區域自由能（△G°）小於58.6lkJ/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區域時，用7-deaza-2′-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。

11.引物應具有特異性。 引物設計完成以後，應對其進行BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補性，就可以進行下一步的實驗了。

『叄』 所謂引物的Tm值，到底有多少意義

Tm較低，而且熔解溫度范圍較寬；離子強度較高時，Tm較高，熔解溫度范圍較窄。

DNA溶液中離子強度低時，Tm較低，而且熔解溫度范圍較寬；離子強度較高時，Tm較高，熔解溫度范圍較窄。因此，在表示某一來源DNA的Tm值時，必須指出其測定條件。

在一定條件下Tm高低由DNA分子中的G-C含量所決定。G-C含量高時，Tm值比較高，反之則低。這是因為G-C之間的氫鍵較A-T多，解鏈時需要較多的能量之故。Tm值和G-C的含量可用二一個經驗公式表示：（G—C）%=（Tm-69.3）×2.44。

(3)引物tm值多少合適擴展閱讀：

引物使用的相關要求：

1、PCR擴增產物長度： 引物的產物大小不要太大，在80-250bp之間都可；80～150 bp最為合適（可以延長至300 bp）。

2、引物3′端錯配時，不同鹼基引發效率存在著很大的差異，當末位的鹼基為A時，即使在錯配的情況下，也能有引發鏈的合成，而當末位鏈為T時，錯配的引發效率大大降低，G、C錯配的引發效率介於A、T之間，所以3′端最好選擇T。

3、引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是3』端相似性較高的序列，否則容易導致錯誤引發。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種鹼基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。

『肆』 分子生物學高人請幫忙。請教有關PCR的Tm值問題

首先告訴你，Tm值沒什麼用的，你要注意的是退火溫度，比如這是我做16S rDNA的程序，
1）95度 10min（這個一般用94-95度，使DNA完全分開，這步一般固定）
2）95度 30秒（94度、95度都可以，這步幾乎也是固定的）
3）退火溫度 30-60秒（退火溫度你設計引物時會有告訴你的，要是是大片段，將程序建議的退火溫度減去5度，小片度就可以按照它給的溫度，注意，退火溫度是PCR的關鍵，所以一般需要摸索條件的）
4）72度 延伸時間（這步固定，延伸時間與你P的片段大小和你的Taq酶有關，一般是1-2kb/min，也就是說你做1kb大小的片段就用30-60秒，依次類推）
步驟2-4循環30次
5）72度 5-10min
6）15度 10min（此步可有可無）
希望可以幫到你！！
Tm值在你設計引物的時候才會有用，引物的Tm值一般控制在55-60度, 盡可能保證上下游引物的Tm值一致,一般不超過2度. 如果引物中的G+C含量相對偏低,則可以使引物長度稍長,而保證一定的退火溫度.不知道你懂了沒？ 當然，我引物Tm值差5度的也有，照樣P的很好，呵呵。

『伍』 實時PCR產物的Tm值為什麼一般是在80以上

PCR的退火溫度是引物與模板之間的，而real
time
PCR最後的退火溫度是產物之間的。產物的Tm值，指的是PCR產物解鏈一半時的溫度。一般realtime
PCR
的產物大多在70-200bp之間。當然退火溫度會在80以上了。

『陸』 多重熒光定量引物之間TM值相差多少為宜

多重熒光定量引物之間TM值相差Tm值在72℃左右可使復性條件最佳。過高或過低都不利於引發反應。上下游引物的TM值不能相差太大。Tm值的計算有多種方法，如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)。

『柒』 我的引物設計有30個鹼基，tm值分別為88和84，是不是太高了那退火溫度怎麼設定啊謝謝

退火溫度一般是TM值減10度，不過實踐證明低些也能擴出來，我就擴過TM在80左右的，退火溫度沒超過60度就擴出來了。另外，不知你用什麼軟體分析的TM值，不同的軟體好像演算法不太一樣。

『捌』 引物18個鹼基互補序列，Tm值60左右，加上酶切位點和保護鹼基後，Tm值就72了，這么高Tm行嗎

建議不要那麼高.一般TM在50-70.如果實在沒有其他合適引物可以一試.

『玖』 在DNA引物合成的報告單上Tm(1M Na+) 68.25 ; Tm 57.80 分別什麼意思啊請各位高手不吝賜教！多謝了！

樓上的Tm值可不是退火溫度噢應該是primer的核酸值，只是我們平常做PCR的時候可以通過Tm值推算退火溫度罷了

呵呵概念是概念，生物學需要實踐，很多的引物Tm值都可能達到70、80，甚至90，難道你准備PCR的時候用這種溫度退火？

再說了，引物的Tm值高了，不是說提高退火溫度就能P得出來。Tm值高代表GC含量高，特異性就不好，所以才衍生了Touchdown和Slowdown的方法。

貼的圖片是我隨便找的張引物訂單，是一條引物的，有兩個Tm值是不同Na濃度的。還有不同引物的鹼基序列不同，所以Tm不一樣。當然也有可能恰好是相同的，那是鹼基算出來的Tm值恰好相等罷了。

別把無知當學問了，Primerbank里隨便拎條定量引物出來Tm值都能很高，難道你跑定量也用兩步PCR，還有你那兩步PCR的方法都是哪個年代的技術了，P一次就能P出來的東西非得弄得那麼復雜，你覺得做科研的人都很閑？拜託多學習學習國外先進技術，沒事看看JoVE和NatureProtocol吧。

『拾』 我的引物1Tm值是58.2，引物2Tm值是61，用這對引物進行PCR反應退火溫度應該設定為多少，求大神解答。

55°C左右吧~一般退火溫度比Tm值低5度~但要確定一下你的polymerase適用的退火溫度~比如pfu一般不要低於60°C~Taq不低於55°C即可~