引物的tm值与gc含量多少合适

① 引物的TM值如何计算

Tm(解链温度)是指50%双链被解开成单链时的温度。寡核苷酸浓度和盐浓度会影响Tm值的大小。

Tm值有多种计算方法。我们使用近邻法(PNAS83,3746-50)来计算。用这种方法计算前，也有多种方法来估测。如果是15个碱基以下，那么有一种好的方法来估算，对于A和T，可以乘以2癈，对于C和G，可以乘以4癈然后相加，这叫做Wallace法则。

Tm=2℃(A+T)+4℃(G+C)

另一种方法来估计长链中GC含量

Tm=81.5+0.41(%GC)-500/L+16.6log[M]

(L:寡核苷酸的长度；M:1价阳离子的浓度)

但这些方法不能消除碱基堆积的影响，结果并不准确，所以近邻法被广泛的应用。但是，对于在60-70bp或15bp以下的寡核苷酸的测定，近邻法还是有缺点。

Bioneer使用的近邻法具有新的特点。它考虑到在退火过程中不同的碱基序列的影响，并且通过热力学来测定，可以更有效的测定Tm值。比如5'-GC-3'和5'-CG-3'的序列用热力学方法测定结果是不同的。计算方法见截图：

依靠热力学方法，焓和熵通过两个碱基来确定。[salt]是指一价阳离子的浓度，[Oligo]是指反应过程中的寡核苷酸浓度。R是指气体常数(1.987cal•K-1mol-1)。Bioneer用近邻法计算Tm值时，使用的是50mM的盐浓度和1nM的寡核苷酸的浓度。

Bioneer会给每一个用户提供Tm值，但这只是估计值，我们不能保证精确性，因此这个值仅供用户参考。

如果没有扩增出产物，你可以把退火温度降到Tm值以下4～5癈。如果有许多非特异性的产物，你需要改变实验条件如提高退火温度以得到正确的产物。

② pcr实验详细步骤是怎么样的

1、模板的取材主要依据PCR的圹增对象，可以是病原体标本如病毒、也可以是病理生理标本如细胞等。

2、标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品霓要经过SDS和蛋白 酶K处理。难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理。

3、引物最好在模板cDNA的保守区内设计，引物长度一般在15~30碱基之间，引物长度常用的是18~27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应

4、引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃，GC含量过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度

5、引物3’端要避开密码子的第3位，引物3′端不要终止于密码子的第3位，引物3′端不能选择A，最好选择T，引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异。

(2)引物的tm值与gc含量多少合适扩展阅读：

PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。

通过DNA基因追踪系统，能迅速掌握患者体内的病毒含量，其精确度高达纳米级别，精确检测乙肝病毒在患者体内存在的数量、是否复制、是否传染、传染性有多强、是否必要服药、肝功能有否异常改变。

能及时判断病人最适合使用哪类抗病毒药物、判断药物疗效如何、给临床治疗提供了可靠的检验依据。

重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

③ pcr引物设计时，两条引物GC含量相差多少以内合适，12%可以么

一般不能但看GC含量，而要由引物的Tm值来综合判断，一般Tm值在2C以内。而Tm值主要由两个因素控制：GC含量和碱基数目。只要GC含量在40－60%都是可以接受的。12%只要Tm值不超过2C，应该是可以的。但是，您为何要选择相差这么大的引物？可以考虑其它引物啊？除非您要特定区域的，比如要包含起始密码子？

④ 我设计了个PCR引物，但是Tm50度多一点，GC含量40多一点，应该如何修改

就这两个数来看其实可以用了。Tm在50-60，GC%在35-50其实都可以。重要的数据是，你的false priming的预测如何，就是预测的错配概率是多少。另外是否有茎环结构，引物二聚体概率多少，这些是关键数据。你用软件预测一下，都是可以算的。只要这些的概率不大，就没什么问题的。另外你的primer多长？如果不放心的话可以在增加几个nt，提高tm到60，也就是了。不过这真的不关键，毕竟可以做gradient PCR的。

⑤ gc含量太低的引物可以用吗

gc含量太低的引物不可以用。

同一碱基连续出现不应超过5个，GC含量一般40-60%，GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性，GC含量太高也易于引发非特异扩增。

引物长度一般在15~30碱基之间：

引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。
引物GC含量在40%~60%之间，Tm值zui好接近72℃。GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。

另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公 式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃。

⑥ 设计pca引物 主要需要注意哪几点

PCR引物设计的11条黄金法则

1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。

2.引物长度一般在15~30碱基之间。
引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。

3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。
GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

4.引物3′端要避开密码子的第3位。
如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

5.引物3′端不能选择A，最好选择T。
引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。

6. 碱基要随机分布。
引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。

7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。
两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′ 端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Cross dimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。
引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。

8. 引物5′ 端和中间△G值应该相对较高，而3′ 端△G值较低。
△G值是指DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。应当选用5′ 端和中间△G值相对较高，而3′ 端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3′ 端的△G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。（不同位置的△G值可以用Oligo 6软件进行分析）

9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。
引物的5′ 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′ 端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。
引物的延伸是从3′ 端开始的，不能进行任何修饰。3′ 端也不能有形成任何二级结构可能。

10. 扩增产物的单链不能形成二级结构。
某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6l kJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。

11. 引物应具有特异性。
引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。

值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。
做Real Time时,用于SYBR Green I法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求：
1)避免重复碱基，尤其是G.
2)Tm=58-60度。
3）GC=30-80%.
4)3'端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C.
5)正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。
6)PCR扩增产物长度： 引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80～150 bp最为合适（可以延长至300 bp）。
7)引物的退火温度要高，一般要在60度以上；

要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。

而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。

至于设计软件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMER EXPRESS都应该可以的。

做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不容易。

关于BLAST的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在GENEBANK中公开的不物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用。

⑦ 荧光定量PCR引物设计

完全可以，PCR长度从50bp到数百都可以，不止局限于150-300个碱基对。楼上说的有道理，但是有一点要注意，最好计算一下扩增片段的Tm值，这样做溶解曲线的时候，光有一个峰还不够，而且得到的TM和你计算的Tm相吻合才行。
是否在翻译区没有影响。

⑧ 引物的GC%很大，行吗

一般40%-60%,70%-80%问题应该也不大，GC含量高，TM值高，正常情况下是可以扩增出来的

⑨ 引物设计问题

引物设计原则：

1。长度 一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq酶的最适温度
2。碱基分布的均衡性 同一碱基连续出现不应超过5个
GC含量一般40-60%
GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性
GC含量太高也易于引发非特异扩增。
3。引物Tm值 一般要求：55℃-65℃。
计算：
对于低于20个碱基的引物，Tm值可根据Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算
对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参数，从“最近邻位”的计算方式得到，这也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。
Tm = △H/(△ S + R * ln (C/4)) + 16.6 log ([K+]/(1 + 0.7 [K+])) - 273.15
4。引物二级结构 引物二聚体
尽可能避免两个引物分子之间3’端有有较多碱基互补
发夹结构
尤其是要避免引物3’端形成发夹结构，否则将严重影响DNA聚合酶的延伸。
5。引物3’端 引物的延伸从3’端开始，因此3’端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，甚至导致PCR扩增完全失败。考虑到密码子的简并性，引物3’端最后一个碱基最好不与密码子第三个碱基配对。
6。引物5’端 引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基，在5’端引入一段非模板依赖性序列。
5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5’端加上适当数量的保护碱基）。
5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究。
5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。
6。引物的内部稳定性 过去认为，引物3’端应牢牢结合在模板上才能有效地进行延伸，故3’端最好为G或C。
现在的观点认为，引物的5’端应是相对稳定结构，而3’端在碱基配对的情况下最好为低稳定性结构，即3’端尽可能选用A或T，少用G或C。
仅仅3’端几个碱基与非特异位点上的碱基形成的低稳定性结构是难以有效引发引物延伸的。
如果3’端为富含G、C的结构，只需3’端几个碱基与模板互补结合，就可能引发延伸，造成假引发。
7。引物的保守性与特异性 保守性：通用引物——检测同一类病原微生物尽可能多的型别
特异性：避免非特异性扩增

⑩ 所谓引物的Tm值，到底有多少意义

Tm较低，而且熔解温度范围较宽；离子强度较高时，Tm较高，熔解温度范围较窄。

DNA溶液中离子强度低时，Tm较低，而且熔解温度范围较宽；离子强度较高时，Tm较高，熔解温度范围较窄。因此，在表示某一来源DNA的Tm值时，必须指出其测定条件。

在一定条件下Tm高低由DNA分子中的G-C含量所决定。G-C含量高时，Tm值比较高，反之则低。这是因为G-C之间的氢键较A-T多，解链时需要较多的能量之故。Tm值和G-C的含量可用二一个经验公式表示：（G—C）%=（Tm-69.3）×2.44。

(10)引物的tm值与gc含量多少合适扩展阅读：

引物使用的相关要求：

1、PCR扩增产物长度： 引物的产物大小不要太大，在80-250bp之间都可；80～150 bp最为合适（可以延长至300 bp）。

2、引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。

3、引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。