两个酶切位点相隔多少比较合适

1. 酶切位点怎么选择

酶切位点的距离太小（小于10bp），影响限制性内切酶对切点的识别，不利于空载体的双酶切（会切不开哟！）
（1）一般目的基因用于克隆表达的情况下，酶切位点的选择要考虑到：
目的基因片段内部不含有所选的酶切位点（不然鉴定阳性重组子双酶切时会将目的基因切断）
（2）实验后继应用的所有载体(真核、原核、酵母、昆虫)都尽可能含有所选的酶切位点．并且要保证在载体上的插入方向正确（定向克隆）。（不然换载体表达时，还要重新设计引物，以引进新的酶切位点）
（3）尽可能选比较常用的酶切位点。（常用切点酶的价格比较便宜）

2. 质粒上有两组相同的酶切位点，越远越容易切开吗

酶切位点前后有一定数量的碱基可以保证酶活性单元有效结合，并有效进行酶切反应，一般情况下稍微远点是会更有效，但是如果你使用的酶存在星活性或其他钝化特性，那就要好好看看了~

3. 载体上临近的两个酶切位点可以设计起来做双酶切吗

酶切专家(站内联系TA)
这的看具体情况,一般来说,不建议用紧邻的两个酶切位点,可能影响其中一个的酶切效率.但也需要具体情况来分析,如果可能,将你的具体序列发上来,大家帮你分析XOooZzz(站内联系TA)
做是可以,不过建议酶切后用CIAP处理,以防止里面的单酶切片段自连.
cicelyzh(站内联系TA)
要根据距离和哪种限制酶的情况而定.有些能切开,有些不行.
jwucn(站内联系TA)
:hand:.帮您顶一个.:hand:zqxabc(站内联系TA)
可以的,临近的两个酶切位点可以分步酶切,一个一个切,先切一个,然后不跑胶直接加Binding buffer过柱洗脱,回收产物再进行下一个酶切.因分步酶切有损耗,所以质粒的量可以增加以保证回收浓度joan198108(站内联系TA)
尽量不要,临近位点可能导致一个酶的结合影响另一个酶的结合,还有就是有些酶需要的结合片段较长,分步酶切后也不一定能够实现山水88(站内联系TA)
可以的话把序列放上来大家给你分析吧
...山雨(站内联系TA)
这样子不好,酶切的效果好需要一定长度是保护碱基,挨着的位点切不动,分步切的话,buffer不一样,效果也非常一般,建议在引物上加酶切位点,这样就不受载体的限制了.
cory0931(站内联系TA)on yr re:
质粒的两个酶切位点,紧挨着的话,势必会影响双酶切效果,原因是：
内切酶结合时,一般都是需要微点周围有多余碱基,否则影响结合；
再者,酶切后的粘性末端不余怒重合；
若是连个酶切位点之间有几个碱基的间隔,比如说6个以上,一般是可以的；
至少,也得间隔4个碱基吧；
若是直接没有间隔,目前貌似没有多少成功的文献可循；wx1990(站内联系TA)
理论上可以,我最近做了个双酶切实验,两个酶切位点之间相隔五六个碱基,效果不错,但是最好不要紧挨着

4. 构建表达载体时，两个基因之间要间隔多少序列

先看表达载体有哪些合适的酶切位点，比如NdeI,NcoI这样识别序列有ATG起始密码子的，再看看目的基因含不含有这些位点，含有就不好连接了，挑好位点，计算下读码框是否正确，保证核糖体结合位点后的第一个ATG与目的基因是间隔3的倍数个碱基。下游的位点更好选，如果有6xHis标签，想融合表达的话，就注意下要是同一读码框，同时利用载体的终止密码子，如果没有这样的需要，就利用目的基因本身的终止密码子好了。基本是这样，具体还是看看书吧。

5. 酶切位点选择与阅读框的调整

【案例】

使用双酶切的方式将一段基因序列插入pDsRed2-N1质粒中，使其能够与DsRED蛋白进行融合表达。

【1. 序列导入】

pDsRed2-N1质粒可以直接在SnapGene的序列库中找到，导入方式在前面的文章中已经介绍，这里不再赘述。从图谱中选择多克隆位点区域MCS，点击，并转到序列页面：

同时，新建DNA序列，将目的基因的序列粘贴进去，用于后续的酶切位点分析。

敲黑板！！！

【2. 酶切位点分析】

双酶切连接的酶需要满足以下要求：

一、酶切位点需要存在于MCS中，但同时不能存在于目的基因序列中。

二、两个酶切位点之间至少要有几个碱基间隔，不能紧邻或重叠。

三、最好选择成熟的内切酶。

四、结合实验室酶库，最好保证内切酶能在同一最佳缓冲液进行反应

五、双酶切后末端不会发生自连

按照以上原则，我们先看基因中的常见酶切位点：

然后在MCS中排除这些酶切位点：

之后在剩下的酶切位点中，选择常用的即可，因为HindIII、EcoRI两个酶切位点靠的太近，没有选择这两个的组合，以免造成双酶切的效率下降。因此，最终选择的是EcoRI+KpnI的酶切组合。同时，发现EcoRI酶和KpnI酶的最佳NEB反应缓冲液不一样，查看EcoRI酶和KpnI酶的TAKARA双酶切体系，推荐使用TAKARA的M缓冲液。

【3. 调整融合表达的阅读框】

因为目的基因需要融合下游的荧光蛋白进行示踪，所以调整阅读框的通顺性是非常重要的，首先将目的基因中的终止密码子去除，然后将载体上EcoRI+KpnI之间的序列替换为去除终止密码子之后的目的基因的序列：

观察目的基因向下游表达至DsRed2中的氨基酸序列（HGL），发现与DsRed2原始序列（MAS）不同，即发生了移码，完整的阅读框遭到了破坏。因此，我们需要在目的基因下游与KpnI之间添加碱基恢复其阅读框的正确。

从上图中可以看出，当添加了两个碱基之后，之前的两个不同的氨基酸序列合二为一，变为正确的序列，即目的Gene可以跟下游的DsRed2基因进行正确的融合表达了。(如果您的蛋白序列3端不是核心功能区，去掉一个碱基同样可以修复阅读框)

6. tdna插入的引物设计在哪比较合适

先用软件设计出合适的引物，引物的3’端是引发延伸的起点，因此一定要与模板准确配对， 应尽量避免在引物 3’端的第一位碱基是 A。（容易错配）引物 3’端最佳碱基的选择是 C，因为他们形成的碱基配对比较稳定。目的序列上并不存在的附加序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5'端而不影响特异性。当计算引物Tm 值时并不包括这些序列， 但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。 酶切位点都需要保护碱基以利于内切酶的有效切割。酶切位点前加保护碱基 1，两个酶切点 至少隔上3 个碱基，在做载体构建的时候设计引物扩增片段进行定向连接，除了酶切位点， 还要在两端加一个三个核苷酸的保护序列，否则 PCR 产物很难被酶切，因此就会导致连接 失败，因为内切酶需要一定的辅助性碱基才能顺利切割，在没有辅助碱基的情况下，有的酶 是可以切割的

7. 相隔1Kb的两个酶切位点在进行双酶切时会破坏彼此的酶切位点吗如果会,有没有避免的方法谢谢!

这个距离隔得算是还可以啊，一般一个酶的作用位点才4-6个碱基，1000个碱基还相互干扰的比较少。如果特别担心，可以换成两次单酶切，先切A，稍微过下柱子，再切B，如果没有问题，反过来用B先切，过柱后再切A。如果两种都没问题，可能要考虑是不是两种酶一起双酶切的时候，buffer或者温度选的不合适，或者是其中一个酶产生了星号活性，有非特异切割，导致你目前碰到的问题。
如果上述都没问题，那么说明AB两个酶一起双切是不应该有问题。如果发现找不到合适的通用buffer，最后就还是只能分开切了。

8. 质粒图谱上两个酶切位点距离太近6bp影响酶切吗

要具体看这两个酶的序列之间隔了多少个bp，有些酶的话隔的太近的话
双酶切
效率很低，需要分别单酶切；还有就是如果这两个酶共用碱基的话就不行，两个酶只相当于一个酶。

9. 载体双酶切时两酶切位点距离12bp容易切吗

这个可以切，不过最好还是选择两个相距较好的切比较好。

10. 如果我做双酶切的话，两个酶切位点之间距离很近总是切不出来，怎么办请求高手指点。

如果你是切载体，那是没有办法避免的，载体上最远的酶切位点在电泳上也是看不出来的，如果你用的酶是不同的缓冲液，那就先用低盐切，然后用高盐切，应该没有问题，我们实验室就是这样做的，要不就先用一种盐切，然后用酒精洗涤沉淀一下，再换另一个酶切，应该也是可以的