引物tm值多少合适

‘壹’ 设计PCR引物时Tm温度有没有具体要求比如说，Tm必须小于72度，或大于72度

PCR引物的Tm最好在55℃以上，以减少引物错配。一般以60℃~65℃左右为宜。

‘贰’ pcr引物设计的基本原则有哪些

PCR引物设计的11条黄金法则

1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。

2.引物长度一般在15~30碱基之间。 引物长度（primerlength）常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。

3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。 GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

4.引物3′端要避开密码子的第3位。 如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

5.引物3′端不能选择A，最好选择T。 引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。

6.碱基要随机分布。引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的列，否则容易导致错误引发（Falsepriming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。

7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Crossdimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。

8.引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。 △G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。应当选用5′端和中间△G值相对较高，而3′端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3′端的△G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。（不同位置的△G值可以用Oligo6软件进行分析）

9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。 引物的5′端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能。

10.扩增产物的单链不能形成二级结构。某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。

11.引物应具有特异性。 引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。

‘叁’ 所谓引物的Tm值，到底有多少意义

Tm较低，而且熔解温度范围较宽；离子强度较高时，Tm较高，熔解温度范围较窄。

DNA溶液中离子强度低时，Tm较低，而且熔解温度范围较宽；离子强度较高时，Tm较高，熔解温度范围较窄。因此，在表示某一来源DNA的Tm值时，必须指出其测定条件。

在一定条件下Tm高低由DNA分子中的G-C含量所决定。G-C含量高时，Tm值比较高，反之则低。这是因为G-C之间的氢键较A-T多，解链时需要较多的能量之故。Tm值和G-C的含量可用二一个经验公式表示：（G—C）%=（Tm-69.3）×2.44。

(3)引物tm值多少合适扩展阅读：

引物使用的相关要求：

1、PCR扩增产物长度： 引物的产物大小不要太大，在80-250bp之间都可；80～150 bp最为合适（可以延长至300 bp）。

2、引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。

3、引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。

‘肆’ 分子生物学高人请帮忙。请教有关PCR的Tm值问题

首先告诉你，Tm值没什么用的，你要注意的是退火温度，比如这是我做16S rDNA的程序，
1）95度 10min（这个一般用94-95度，使DNA完全分开，这步一般固定）
2）95度 30秒（94度、95度都可以，这步几乎也是固定的）
3）退火温度 30-60秒（退火温度你设计引物时会有告诉你的，要是是大片段，将程序建议的退火温度减去5度，小片度就可以按照它给的温度，注意，退火温度是PCR的关键，所以一般需要摸索条件的）
4）72度 延伸时间（这步固定，延伸时间与你P的片段大小和你的Taq酶有关，一般是1-2kb/min，也就是说你做1kb大小的片段就用30-60秒，依次类推）
步骤2-4循环30次
5）72度 5-10min
6）15度 10min（此步可有可无）
希望可以帮到你！！
Tm值在你设计引物的时候才会有用，引物的Tm值一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度. 如果引物中的G+C含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度.不知道你懂了没？ 当然，我引物Tm值差5度的也有，照样P的很好，呵呵。

‘伍’ 实时PCR产物的Tm值为什么一般是在80以上

PCR的退火温度是引物与模板之间的，而real
time
PCR最后的退火温度是产物之间的。产物的Tm值，指的是PCR产物解链一半时的温度。一般realtime
PCR
的产物大多在70-200bp之间。当然退火温度会在80以上了。

‘陆’ 多重荧光定量引物之间TM值相差多少为宜

多重荧光定量引物之间TM值相差Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的TM值不能相差太大。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)。

‘柒’ 我的引物设计有30个碱基，tm值分别为88和84，是不是太高了那退火温度怎么设定啊谢谢

退火温度一般是TM值减10度，不过实践证明低些也能扩出来，我就扩过TM在80左右的，退火温度没超过60度就扩出来了。另外，不知你用什么软件分析的TM值，不同的软件好像算法不太一样。

‘捌’ 引物18个碱基互补序列，Tm值60左右，加上酶切位点和保护碱基后，Tm值就72了，这么高Tm行吗

建议不要那么高.一般TM在50-70.如果实在没有其他合适引物可以一试.

‘玖’ 在DNA引物合成的报告单上Tm(1M Na+) 68.25 ; Tm 57.80 分别什么意思啊请各位高手不吝赐教！多谢了！

楼上的Tm值可不是退火温度噢应该是primer的核酸值，只是我们平常做PCR的时候可以通过Tm值推算退火温度罢了

呵呵概念是概念，生物学需要实践，很多的引物Tm值都可能达到70、80，甚至90，难道你准备PCR的时候用这种温度退火？

再说了，引物的Tm值高了，不是说提高退火温度就能P得出来。Tm值高代表GC含量高，特异性就不好，所以才衍生了Touchdown和Slowdown的方法。

贴的图片是我随便找的张引物订单，是一条引物的，有两个Tm值是不同Na浓度的。还有不同引物的碱基序列不同，所以Tm不一样。当然也有可能恰好是相同的，那是碱基算出来的Tm值恰好相等罢了。

别把无知当学问了，Primerbank里随便拎条定量引物出来Tm值都能很高，难道你跑定量也用两步PCR，还有你那两步PCR的方法都是哪个年代的技术了，P一次就能P出来的东西非得弄得那么复杂，你觉得做科研的人都很闲？拜托多学习学习国外先进技术，没事看看JoVE和NatureProtocol吧。

‘拾’ 我的引物1Tm值是58.2，引物2Tm值是61，用这对引物进行PCR反应退火温度应该设定为多少，求大神解答。

55°C左右吧~一般退火温度比Tm值低5度~但要确定一下你的polymerase适用的退火温度~比如pfu一般不要低于60°C~Taq不低于55°C即可~